L'apparition de la variation de la longueur de l'ADN des fragments qui se sont produites après clivage avec une endonucléase de restriction de type II. Les différences de longueurs de l'ADN sont dues à la présence ou l'absence de sites de reconnaissance pour cette enzyme de restriction particulière. RFLP était initialement détectées par hybridation avec des sondes d'ADN après la séparation de l'ADN génomique digéré par électrophorèse sur gel (analyse du Sud). Maintenant, ils sont généralement détectés par électrophorèse du produit PCR digéré.