Μια κατηγορία τις ενδονουκλεάσεις που διασπά το DNA μετά από να αναγνωρίσει μια συγκεκριμένη ακολουθία, π.χ., H1 Bam (5´GGATCC3´), RI Eco (5´GAATTC3´), και Hin dIII (5´AAGCTT3´). Υπάρχουν τρεις τύποι ένζυμα ενδονουκλεάσεων περιορισμού:

Τύπος ι: περικοπές μη-συγκεκριμένα σε απόσταση μεγαλύτερη από 1000 bp από την ακολουθία του αναγνώριση και περιέχει μεθυλίωση και περιορισμός δραστηριοτήτων.

Τύπος ΙΙ: Περικοπές σε ή κοντά σε μια σύντομη, και συχνά παλινδρομικούς (q.v.), αναγνώριση ακολουθία. Α ξεχωριστό ένζυμο μεθυλιώνει την ίδια ακολουθία αναγνώριση. Μπορεί να κάνει περικοπές στα δύο σκέλη DNA ακριβώς απέναντι από το ένα το άλλο και να δημιουργήσει αμβλύ τελειώνει, ή να υποβάλουν κλιμακωτές περικοπές για τη δημιουργία κολλώδη άκρη. Τον τύπο ΙΙ περιοριστικά ένζυμα είναι αυτά που χρησιμοποιούνται συνήθως στην τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA.

Τύπος ΙΙΙ: περικοπές bp 24-26, κατάντη από μια σύντομη, ασύμμετρη αναγνώριση ακολουθία. Απαιτεί ATP και περιέχει μεθυλίωση και περιορισμός δραστηριοτήτων.