La séquence de nucléotides spécifiques dans l'ADN qui est reconnu par une endonucléase de restriction de type II et à qui il fait une coupe double-brin. Restriction sites comportent généralement quatre ou six paires de bases qui sont généralement palindromiques (q.v.),

par exemple, 5´GGCC3´

3´CCGG5´

les deux brins peuvent être coupés soit en face de l'autre, de créer des extrémités, ou de manière échelonnée, donnant un collant fin, selon l'enzyme impliquée.