Urutan nukleotida - biasanya terdiri dari 4, 6 atau 8 nukleotida - yang diakui oleh dan pembatasan endonuklease (enzim restriksi) yang mengikat. Untuk tipe II pembatasan enzim (yang digunakan dalam eksperimen kloning gen) ianya juga urutan di mana enzim khusus luka (dan enzim mereka sesuai methylate) DNA, yaitu, untuk tipe II enzim, pengakuan situs dan situs target adalah urutan yang sama. Tipe I enzim mengikat ke situs pengakuan mereka dan kemudian membelah DNA di beberapa posisi lebih atau kurang acak di luar situs pengakuan tersebut.