מחלקה של endonucleases cleaves דנ א לאחר זיהוי רצף מסוים, למשל, באם H1 (5´GGATCC3´), תרטר לסביבה RI (5´GAATTC3´), הין (5´AAGCTT3´). ישנם שלושה סוגים של אנזימי הגבלה endonuclease:

סוג i: חתכים הלא ספציפית מרחק גדול מ- 1000 bp של רצף זיהוי שלו והוא מכיל פעילויות הגבלת והן מתילציה.

סוג II: חתכים על או ליד קצר, לעיתים קרובות palindromic (q.v.), זיהוי רצף. A נפרד אנזים methylates אותו רצף זיהוי. הם עשויים להפוך קיצוץ גדילי הדנ א שני בדיוק מול אחד לשני ולהפיק בוטה מסתיים, או שהם עשויים לבצע קיצוצים מתנדנדת ליצור קצוות דביקים. אנזימי הגבלה הסוג השני הם אלה בדרך כלל לנצל טכנולוגיית דנ א רקומביננטי.

סוג III: חתכים 24-26 bp במורד הזרם של רצף זיהוי קצר, סימטרית. דורשת ATP והוא מכיל פעילויות הגבלת והן מתילציה.