Uma classe de endonucleases que cliva o DNA depois de reconhecer uma sequência específica, por exemplo, H1 de Bam (5´GGATCC3´), Eco RI (5´GAATTC3´) e Hin dIII (5´AAGCTT3´). Existem três tipos de enzimas endonucleases de restrição:

tipo i: cortes não específica uma distância maior que 1000 bp da sua sequência de reconhecimento e contém atividades tanto a restrição e a metilação.

Tipo II: Cortes em ou perto de um curto-circuito e muitas vezes palíndromo (q.v.), sequência de reconhecimento. A enzima separada methylates a mesma sequência de reconhecimento. Podem fazer os cortes nas duas cadeias de DNA exatamente em frente um do outro e gerar rombas termina, ou eles podem fazer cortes escalonados para gerar extremidades pegajosas. o tipo II de enzimas de restrição são as comumente exploradas na tecnologia do DNA recombinante.

Tipo III: cortes bp 24-26 a jusante de uma sequência de reconhecimento curto, assimétrico. Requer ATP e contém atividades tanto restrição e metilação.