Các kỹ thuật đó DNA chèn và vector phân tử được tiêu hóa với hai enzyme giới hạn khác nhau để tạo ra phòng không bổ sung kết thúc dính ở hai đầu mỗi đoạn hạn chế, vì vậy cho phép chèn đến được ligated để vector trong một hướng cụ thể và ngăn chặn các véc tơ tái circularizing.